Kit ELISA pour le facteur de nécrose tumorale alpha humain

 

 

Référence produit : YP-W11776

Spécification : 96T 

Plage de détection : 2,5 pg/ml – 80 pg/ml.

Sensibilité : La dose minimale détectée est inférieure à 0,1 pg/ml.

Précision : Le coefficient de variation intra-série CV% est inférieur à 10 % ; le coefficient de variation inter-série CV% est inférieur à 15 %.

Taux de recouvrement : Le taux de recouvrement est compris entre 85 % et 115 %.

Spécificité : Ce kit reconnaît le facteur de nécrose tumorale α humain naturel et recombinant (TNF-α) sans réaction croisée avec des analogues structuraux. Stabilité : Conservation à 2°C-8°C, valable 6 mois.

Utilisation : Utilisé pour détecter la concentration de facteur de nécrose tumorale α humain (TNF-α) dans des échantillons tels que le sérum, le plasma, le surnageant de culture cellulaire et les tissus.

 

Principe expérimental

Ce kit utilise un test immuno-enzymatique (ELISA) en sandwich à double anticorps. Dans la plaque enzymatique microporeuse pré-enrobée d'anticorps anti-facteur de nécrose tumorale α humain (anticorps en phase solide), le calibrateur de facteur de nécrose tumorale α humain (TNF-α) et l'échantillon à tester ont été ajoutés, puis l'anticorps anti-facteur de nécrose tumorale α humain marqué à la HRP (anticorps marqué aux enzymes) a été ajouté. Après incubation et lavage complet, les composants non liés ont été éliminés et un complexe sandwich anticorps en phase solide-antigène-anticorps marqué aux enzymes a été formé sur la surface de la phase solide de la microplaque. Les substrats A et B sont ajoutés, le substrat est catalysé par la HRP, et le substrat est produit, qui est finalement converti en jaune sous l'action de la solution d'arrêt (solution acide). L'absorbance (valeur DO) a été mesurée à une longueur d'onde de 450 nm sur le lecteur de microplaques, et l'absorbance (valeur DO) était positivement corrélée à la concentration de facteur de nécrose tumorale α (TNF-α) dans l'échantillon à tester. En ajustant la courbe de calibration, la concentration de facteur de nécrose tumorale α (TNF-α) dans l'échantillon peut être calculée.

 

Composants du kit et stockage : Les kits non ouverts sont conservés à 2-8 degrés et les kits périmés ne doivent pas être utilisés.

Composants	Configuration 48 puits	Configuration 96 puits	Stockage après ouverture
Plaque enzymatique pré-enrobée	48T	96T	2-8℃ 14 jours
Standard	0,3mL*6 tubes	Tube de 0,3 ml*6	2-8℃ 14 jours
Dilution d'échantillon	3 ml	6 ml	2-8℃ 180 jours
Anticorps marqués à la HRP	5 ml	10 ml	2-8℃ 14 jours
Substrat colorogène A	3 ml	6 ml	2-8℃ 180 jours
Substrat colorogène B	3 ml	6 ml	2-8℃ 180 jours
Solution d'arrêt	3 ml	6 ml	2-8℃ 180 jours
Solution de lavage 20×	15 ml	25 ml	2-8℃ 180 jours
Film d'étanchéité	2 photos	2 photos
Manuel	1 exemplaire	1 exemplaire
Sachet auto-scellant	1	1

Les concentrations des calibrateurs sont :  80、40、20、10、5、2,5 pg/ml  dans cet ordre.

 

Remarque :

 

1 : Avant utilisation, veuillez vérifier si l'étiquette et la quantité de réactif dans le kit correspondent au tableau.

2 : Si les composants du kit doivent être réutilisés, veuillez vous assurer qu'ils ne sont pas contaminés après la dernière utilisation. 3 : La plaque enzymatique n'a pas été utilisée en une seule fois. N'oubliez pas de la sceller et de la conserver entre 2 et 8 °C.

 

Équipement de test fourni par l'utilisateur requis pour le test

 (non fourni, mais une aide à l'achat est possible)

 

1) Lecteur de microplaques capable de détecter une absorbance de 450 nm

2) Pipette et embout, bac de remplissage d'échantillons

3) Étuve à température constante ou bain-marie à 37 °C

4) Tubes à essai, tubes à centrifuger, éprouvettes graduées, etc. pour la préparation des réactifs

5) Eau distillée ou eau déionisée

6) Agitateur vortex, agitateur de microplaques

 

 

Remarques

 

1) Ce produit est destiné uniquement à la recherche scientifique et ne doit pas être utilisé pour le diagnostic clinique.
2) À utiliser dans la limite de la période de validité indiquée sur le kit, ne pas utiliser de produits périmés.

3) Ne pas mélanger avec des kits ou des composants d'autres fabricants, utiliser le diluant d'échantillon fourni avec le kit.

4) Si la valeur de l'échantillon est supérieure à la concentration standard la plus élevée, veuillez diluer l'échantillon de manière appropriée avant de procéder à une nouvelle mesure.

5) Les anticorps hétérophiles tels que les anticorps anti-souris humains dans l'échantillon à tester interféreront avec les résultats de la détection. Veuillez éliminer ce facteur avant le test.

6) Les résultats des tests obtenus par d'autres méthodes ne sont pas directement comparables aux résultats des tests de ce kit.

7) Veuillez porter des vêtements de laboratoire et des gants en latex pour vous protéger pendant le test. Surtout lors du test de sang ou d'autres échantillons de fluides corporels, veuillez suivre les réglementations nationales en matière de protection et de sécurité dans les laboratoires biologiques.

8) Incuber en respectant strictement le temps et la température prescrits pour garantir des résultats précis. Tous les réactifs doivent atteindre la température ambiante (20-25 °C) avant utilisation. Remettre au réfrigérateur immédiatement après utilisation.

9) Un lavage incorrect de la plaque peut conduire à des résultats inexacts. Assurez-vous d'aspirer le liquide dans les pores autant que possible avant d'ajouter le substrat. Ne laissez pas les micropores sécher pendant l'incubation.

10) Éliminez les résidus de liquide et les empreintes digitales sur le fond de la plaque, sinon cela affectera la valeur de DO.

11) Le liquide de production de couleur du substrat doit être incolore ou très clair.

12) Évitez toute contamination croisée des réactifs et des spécimens pour éviter d'obtenir des résultats erronés.

13) Évitez l'exposition directe à une lumière forte pendant le stockage et l'incubation.

14) Le lecteur de microplaques utilisé pour la détection doit être équipé d'un filtre capable de détecter des longueurs d'onde de 450±10 nm, avec une plage de densité optique comprise entre 0 et 3,5. Il est recommandé de le préchauffer 15 minutes à l'avance lors de son utilisation.

15) Le tube EP et l'embout d'aspiration utilisés pour le test sont à usage unique et il est strictement interdit de les mélanger.

 

Préparation et conservation des échantillons

            Ce qui suit ne constitue que des directives générales pour le prélèvement et la conservation des échantillons. Lors du prélèvement et du stockage de tous les échantillons, l'azide de sodium ne doit pas être utilisé comme conservateur. Si l'échantillon n'est pas analysé immédiatement, il doit être divisé en aliquotes, congelé et les cycles de congélation-décongélation répétés doivent être évités.

Surnageant de culture cellulaire - centrifuger pour éliminer le précipité, analyser immédiatement ou diviser en aliquotes et conserver congelé à -20 °C.

Sérum - Recueillir le sang dans un tube à essai propre, laisser coaguler à température ambiante pendant 30 minutes, centrifuger à 2 000×g pendant 20 minutes, et recueillir le sérum. Analyser immédiatement ou diviser en aliquotes et conserver congelé à -20 °C.

Plasma - Utiliser de l'héparine, du citrate ou de l'EDTA pour l'anticoagulation, et centrifuger entre 2 et 8 °C à 2 000×g pendant 20 minutes dans les 30 minutes suivant le prélèvement sanguin. Pour éliminer les effets des plaquettes, il est recommandé de centrifuger davantage à 2-8 °C à 10 000×g pendant 10 minutes. Analyser immédiatement ou diviser en aliquotes et cryoconserver à -20 °C.

Lysat cellulaire - Pour les cellules adhérentes, retirer le milieu de culture et laver avec du PBS, une solution saline ou un milieu de culture sans sérum. Ajouter une quantité appropriée de lysat et mélanger avec une pipette quelques fois pour que le lysat et les cellules soient en contact total. Habituellement, après 10 secondes, les cellules sont lysées. Pour les cellules en suspension, recueillir les cellules par centrifugation et laver avec du PBS, une solution saline ou un milieu de culture sans sérum. Ajouter une quantité appropriée de lysat, mélanger les cellules avec une pipette, et tapoter avec vos doigts pour lyser complètement les cellules. Après une lyse suffisante, centrifuger à 10 000-14 000×g pendant 3 à 5 minutes et retirer le surnageant. Analyser immédiatement ou diviser en aliquotes et cryoconserver à -20 °C.

Homogénat tissulaire - Rincer le tissu avec du PBS pré-refroidi (0,01 M, pH=7,4) pour éliminer le sang résiduel (les globules rouges lysés dans l'homogénat affecteront les résultats de la mesure), et couper le tissu après pesée. Placer le tissu coupé et le volume correspondant de PBS (généralement dans un rapport poids-volume de 1:9, par exemple, 1 g d'échantillon de tissu correspond à 9 ml de PBS. Le volume spécifique peut être ajusté de manière appropriée en fonction des besoins expérimentaux et doit être enregistré. Il est recommandé d'ajouter des inhibiteurs de protéase au PBS) dans un homogénéisateur en verre et broyer soigneusement sur de la glace. Pour lyser davantage les cellules tissulaires, l'homogénat peut être soumis à des ultrasons ou à des cycles de congélation-décongélation répétés. Enfin, l'homogénat a été centrifugé à 5 000×g pendant 5 à 10 minutes, et le surnageant a été prélevé pour le test.

Urine – recueillir avec un tube stérile et centrifuger à 2 000×g pendant 20 minutes. Recueillir soigneusement le surnageant. Si un précipité se forme, centrifuger à nouveau.

 

Préparation des réactifs

 

1. Avant utilisation, tous les composants doivent être réchauffés pendant au moins 60 minutes pour assurer un réchauffement complet à température ambiante.
2. Liquide de lavage concentré : Le liquide de lavage concentré sorti du réfrigérateur produira une cristallisation, ce qui est un phénomène normal. La cristallisation est complètement dissoute en chauffant au bain-marie. Le liquide de lavage concentré et l'eau distillée sont dilués à 1:20, c'est-à-dire 1 partie de liquide de lavage concentré pour 19 parties d'eau distillée. 3. Substrat : substrats liquides A et B, bien mélanger à un volume de 1:1 avant utilisation, et utiliser dans les 15 minutes suivant le mélange.

 

Procédures opérationnelles :

Avant toute chose, amenez tous les réactifs et composants à température ambiante ; il est recommandé de préparer les puits pour les composés.

1. Préparez la solution de travail des divers composants du kit selon la méthode décrite dans les instructions précédentes.

2. Retirez les barrettes nécessaires du sachet en aluminium, scellez les barrettes restantes dans un sachet auto-obturant et remettez-les au réfrigérateur.

3. Préparez des puits pour les étalons, des puits pour la valeur 0, des puits à blanc et des puits pour les échantillons. Ajoutez 50 μL d'étalons à différentes concentrations dans chaque puits étalon, ajoutez 50 μL de diluant d'échantillon pour les puits de valeur 0, n'ajoutez rien dans les puits à blanc, et ajoutez 50 μL de l'échantillon à tester.

4. Hormis pour les puits à blanc, ajoutez 100 μL d'anticorps de détection marqué à la peroxydase de raifort (HRP) dans les puits étalons, les puits de valeur 0 et les puits d'échantillon.

5. Couvrez la plaque de réaction avec un film scellant et incubez au bain-marie à 37 °C ou dans une étuve à température constante, à l'abri de la lumière, pendant 60 minutes.

6. Retirez le film scellant, jetez le liquide, séchez la plaque en la tapotant sur du papier absorbant, remplissez chaque puits avec du liquide de lavage, laissez reposer 20 s, secouez pour éliminer le liquide de lavage, séchez sur du papier absorbant et répétez l'opération 5 fois. Si vous utilisez un laveur de plaques automatique, veuillez suivre la procédure d'utilisation du laveur et ajouter un programme de trempage de 30 secondes pour améliorer la précision de la détection. Après le lavage, tapotez soigneusement la plaque de réaction sur du papier propre qui ne peluche pas avant d'ajouter le substrat. (Conseil : pour obtenir des résultats expérimentaux idéaux, le liquide résiduel doit être complètement éliminé. Après le lavage, veuillez effectuer l'étape suivante immédiatement et ne laissez pas la microplaque sécher.) 7. Mélangez bien les substrats A et B dans un volume 1:1, et ajoutez 100 μL du mélange de substrats dans tous les puits. Couvrez la plaque de réaction avec un film scellant et incubez au bain-marie à 37 °C ou dans une étuve à température constante, à l'abri de la lumière, pendant 15 minutes.

8. Ajoutez 50 μL de solution d'arrêt dans tous les puits et lisez l'absorbance (valeur DO) de chaque puits sur un lecteur de microplaques à une longueur d'onde de 450 nm.

Calcul des résultats

1. Utilisez la concentration de l'étalon comme abscisse et l'absorbance correspondante (valeur DO) comme ordonnée. Utilisez un logiciel informatique et un ajustement de courbe logistique à quatre paramètres (4-pl) pour créer l'équation de la courbe étalon. À partir de l'absorbance (valeur DO) de l'échantillon, utilisez l'équation pour calculer sa concentration. [Effectuez le calcul à l'aide du logiciel ELISA Calc. Il est recommandé d'utiliser un ajustement à quatre paramètres pour la courbe étalon, mais ce n'est pas la seule méthode d'ajustement].

2. Si l'échantillon a été dilué, la valeur de concentration mesurée par la méthode ci-dessus doit être multipliée par le facteur de dilution pour déterminer la concentration finale de l'échantillon. Remarque : Les expérimentateurs doivent établir une courbe étalon basée sur leurs propres expériences. Pour chaque essai, une courbe étalon doit être établie pour chaque plaque enzymatique.