Kit ELISA de détection des anticorps anti-papillomavirus humain 16

Pour la recherche scientifique uniquement

Ne pas utiliser pour un diagnostic clinique

 

 

 

N° de produit : YP-W12047
Spécification : 96T

Performance du kit Plage de détection :  25 U/mL – 800 U/mL.

Sensibilité : La dose minimale détectée est inférieure à 1,0 U/mL.

Précision : Le coefficient de variation intra-série (CV%) est inférieur à 10 % ; le coefficient de variation inter-série (CV%) est inférieur à 15 %.

Taux de récupération : Le taux de récupération est compris entre 85 % et 115 %.

Spécificité : Ce kit reconnaît l'anticorps naturel et recombinant contre le papillomavirus humain 16（Ac HPV16） sans réaction croisée avec des analogues structurels.

Stabilité : Conservation entre 2℃ et 8℃, valide pendant 6 mois.

Utilisation : Utilisé pour détecter la concentration d'anticorps contre le papillomavirus humain 16（Ac HPV16） dans des échantillons tels que le sérum, le plasma, le surnageant de culture cellulaire et les tissus.

Durée de conservation : 2℃-8℃, valide pendant 6 mois.

 

Principe expérimental

Le kit utilise une technique ELISA indirecte (enzyme-linked immunosorbent assay). Dans les microplaques pré-enrobées avec l'antigène de capture de l'anticorps anti-papillomavirus humain 16 （Ac HPV16）, l'échantillon à tester et le produit standard sont ajoutés tour à tour, puis l'anticorps de détection marqué à la HRP est ajouté, incubé et soigneusement lavé. Les substrats A et B sont ajoutés, et le substrat produit un produit bleu sous catalyse par la HRP, qui est finalement converti en jaune sous l'action d'une solution d'arrêt (solution acide). L'absorbance (valeur DO) est mesurée à une longueur d'onde de 450 nm sur le lecteur de microplaques ; l'absorbance (valeur DO) est positivement corrélée à la concentration d'anticorps contre le papillomavirus humain 16 （Ac HPV16） dans l'échantillon à tester. En ajustant la courbe d'étalonnage, la concentration d'anticorps contre le papillomavirus humain 16 （Ac HPV16） dans l'échantillon peut être calculée.

 

 

Composants du kit et stockage Les kits non ouverts sont conservés à 2-8 degrés et les kits périmés ne doivent pas être utilisés.

Les concentrations des calibrateurs sont respectivement : 800、400、200、100、50、25 U/mL.

 

 

 

 

Note :

 

1 : Avant utilisation, veuillez vérifier si l'étiquette et la quantité des réactifs dans le kit correspondent au tableau.
2 : Si les composants du kit doivent être réutilisés, assurez-vous qu'ils ne sont pas contaminés après la dernière utilisation. 3 : La plaque de microtitration (plaque ELISA) n'a pas été utilisée pour une seule fois. Pensez à la sceller et à la conserver à 2-8°C.

 

Équipement de test requis fourni par l'utilisateur

(non fourni, mais une aide à l'achat est possible)

 

1) Lecteur de microplaques pouvant détecter une absorbance de 450 nm

2) Pipette et embouts, réservoir de remplissage d'échantillons

3) Étuve à température constante ou bain-marie à 37°C

4) Tubes à essai, tubes à centrifuger, éprouvettes graduées, etc. pour la préparation des réactifs 

5) Eau distillée ou eau déionisée

6) Agitateur vortex, agitateur de microplaques

 

Notes

 

1) Ce produit est destiné uniquement à la recherche scientifique et ne doit pas être utilisé pour un diagnostic clinique.
2) À utiliser dans la limite de la période de validité indiquée sur le kit ; les produits périmés ne doivent pas être utilisés.

3) Ne pas mélanger avec les kits ou les composants d'autres fabricants ; utiliser le diluant d'échantillon fourni avec le kit.

4) Si la valeur de l'échantillon est supérieure à la concentration du standard le plus élevé, veuillez diluer l'échantillon de manière appropriée avant de procéder à une nouvelle mesure.

5) Les anticorps hétérophiles tels que les anticorps anti-souris humains dans l'échantillon à tester interféreront avec les résultats de la détection. Veuillez éliminer ce facteur avant le test.

6) Les résultats des tests obtenus par d'autres méthodes ne sont pas directement comparables aux résultats des tests de ce kit.

7) Veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants en latex pour vous protéger pendant le test. En particulier lors du test d'échantillons de sang ou d'autres fluides corporels, veuillez respecter les réglementations nationales en matière de protection et de sécurité des laboratoires de biologie.

8) Incuber strictement selon le temps et la température prescrits pour garantir des résultats précis. Tous les réactifs doivent atteindre la température ambiante (20-25°C) avant utilisation. Remettre au réfrigérateur immédiatement après utilisation.

9) Un mauvais lavage de la plaque peut conduire à des résultats inexacts. Assurez-vous d'aspirer le liquide dans les puits autant que possible avant d'ajouter le substrat. Ne laissez pas les micropuits sécher pendant l'incubation.

10) Éliminez tout liquide résiduel et toute empreinte digitale sur le fond de la plaque, faute de quoi la valeur de DO en sera affectée.

11) Le liquide de coloration du substrat doit être incolore ou très clair.

12) Évitez la contamination croisée des réactifs et des échantillons pour éviter les résultats erronés.

13) Évitez l'exposition directe à une forte lumière pendant le stockage et l'incubation.

14) Le lecteur de microplaques utilisé pour la détection doit être équipé d'un filtre capable de détecter des longueurs d'onde de 450 ± 10 nm, avec une plage de densité optique comprise entre 0 et 3,5. Il est recommandé de le faire préchauffer 15 minutes à l'avance.

15) Le tube EP et l'embout de pipette utilisés dans le test sont à usage unique et il est strictement interdit de les mélanger.

 

Préparation et conservation des échantillons

            Les directives suivantes ne sont que des indications générales pour le prélèvement et la conservation des échantillons. Lors du prélèvement et du stockage de tous les échantillons, l'azoture de sodium ne doit pas être utilisé comme conservateur. Si l'échantillon n'est pas analysé immédiatement, il doit être aliquoté, congelé et les cycles de congélation-décongélation répétés doivent être évités.

 

Surnageant de culture cellulaire : centrifuger pour éliminer le précipité, analyser immédiatement ou aliquoter et conserver congelé à -20°C.

 

Sérum : prélever le sang dans un tube à essai propre, laisser coaguler à température ambiante pendant 30 minutes, centrifuger à 2000×g pendant 20 minutes et recueillir le sérum. Analyser immédiatement ou aliquoter et conserver congelé à -20°C.

 

Plasma : utiliser de l'héparine, du citrate ou de l'EDTA comme anticoagulant, et centrifuger à 2-8°C à 2000×g pendant 20 minutes dans les 30 minutes suivant le prélèvement sanguin. Pour éliminer les effets des plaquettes, il est recommandé de centrifuger à nouveau à 2-8°C à 10 000×g pendant 10 minutes. Analyser immédiatement ou aliquoter et conserver congelé à -20°C.

 

Lysat cellulaire : pour les cellules adhérentes, retirer le milieu de culture et laver avec du PBS, une solution saline ou un milieu de culture sans sérum. Ajouter une quantité appropriée de lysat et pipeter quelques fois pour assurer un contact total entre le lysat et les cellules. Habituellement, après 10 secondes, les cellules sont lysées. Pour les cellules en suspension, recueillir les cellules par centrifugation et laver avec du PBS, une solution saline ou un milieu de culture sans sérum. Ajouter une quantité appropriée de lysat, pipeter les cellules et agiter avec les doigts pour lyser complètement les cellules. Après une lyse suffisante, centrifuger à 10 000-14 000×g pendant 3-5 minutes et prélever le surnageant. Analyser immédiatement ou aliquoter et conserver congelé à -20°C.

 

Homogénat tissulaire : rincer le tissu avec du PBS pré-refroidi (0,01 M, pH = 7,4) pour éliminer le sang résiduel (les globules rouges lysés dans l'homogénat affecteraient les résultats de mesure), et couper le tissu après pesée. Placer le tissu découpé et le volume correspondant de PBS (généralement dans un rapport poids/volume de 1:9, par exemple, 1 g d'échantillon de tissu correspond à 9 mL de PBS ; le volume spécifique peut être ajusté de manière appropriée selon les besoins expérimentaux et doit être enregistré ; il est recommandé d'ajouter des inhibiteurs de protéases au PBS) dans un homogénéiseur en verre et broyer soigneusement sur glace. Pour lyser davantage les cellules tissulaires, l'homogénat peut être soumis à une sonication ou à des cycles de congélation-décongélation répétés. Enfin, l'homogénat est centrifugé à 5000×g pendant 5 à 10 minutes, et le surnageant est prélevé pour le test.

 

Urine : recueillir dans un tube stérile et centrifuger à 2000×g pendant 20 minutes. Recueillir délicatement le surnageant. Si un précipité se forme, centrifuger à nouveau.

Préparation des réactifs

 

1. Avant utilisation, tous les composants doivent être réchauffés pendant au moins 60 minutes pour garantir qu'ils reviennent à température ambiante.

2. Solution de lavage concentrée : la solution de lavage concentrée sortie du réfrigérateur peut présenter une cristallisation, ce qui est un phénomène normal. Les cristaux sont complètement dissous par chauffage au bain-marie. La solution de lavage concentrée et l'eau distillée sont diluées à 1:20, c'est-à-dire 1 volume de solution de lavage concentrée pour 19 volumes d'eau distillée.

3. Substrat : les solutions de substrat A et B doivent être mélangées soigneusement à un rapport de 1:1 avant utilisation, et utilisées dans les 15 minutes suivant le mélange.

 

Procédures opérationnelles : Tous les réactifs et composants doivent d'abord être ramenés à température ambiante ; il est recommandé de préparer des puits composés.

 

1. Préparer le liquide de travail des différents composants du kit selon la méthode décrite dans les instructions précédentes.
2. Retirer les barrettes nécessaires du sachet en aluminium, sceller les barrettes restantes dans un sachet auto-obturant et les remettre au réfrigérateur.

3. Configurer les puits pour les produits standards et les puits pour les échantillons, et ajouter 50μL de produits standards de différentes concentrations dans chaque puits de standard ;

4. Ajouter 50μL de l'échantillon à tester dans le puits d'échantillon ; ne pas en ajouter dans le puits à blanc.

5. À l'exception des puits à blanc, ajouter 100μL d'anticorps de détection marqué à la peroxydase de raifort (HRP) dans chaque puits de standard et d'échantillon, sceller les puits de réaction avec un film de scellage, et incuber pendant 60 minutes au bain-marie à 37°C ou dans une étuve à température constante.

6. Jeter le liquide, éponger sur du papier absorbant, remplir chaque puits avec du liquide de lavage (350μL), laisser reposer pendant 1 minute, secouer pour éliminer le liquide de lavage, éponger sur du papier absorbant, et répéter le lavage de la plaque 5 fois (il est également possible d'utiliser un laveur de plaques).

(Conseil : pour obtenir des résultats expérimentaux idéaux, le liquide résiduel doit être complètement éliminé. Après avoir lavé la plaque, veuillez effectuer l'étape suivante immédiatement et ne pas laisser la microplaque sécher.)

7. Ajouter 50μL de substrat A et B dans chaque puits, et incuber à 37°C pendant 15 minutes à l'abri de la lumière.
8. Ajouter 50μL de solution d'arrêt par puits et, dans les 15 minutes, déterminer la valeur de DO de chaque puits à une longueur d'onde de 450 nm.

 

Calcul des résultats

 

1.        Utiliser la concentration de la substance standard comme abscisse et l'absorbance correspondante (valeur de DO) comme ordonnée. Utiliser un logiciel informatique et un ajustement de courbe logistique à quatre paramètres (4-pl) pour créer une équation de courbe standard. Grâce à l'absorbance (valeur de DO) de l'échantillon, utiliser l'équation pour calculer la valeur de concentration de l'échantillon. [Calculer en utilisant le logiciel ELISA Calc. Il est recommandé d'utiliser un ajustement à quatre paramètres pour la courbe standard, bien que ce ne soit pas la seule méthode d'ajustement possible]

2.        Si l'échantillon est dilué, la valeur de concentration mesurée par la méthode ci-dessus doit être multipliée par le facteur de dilution pour déterminer la concentration finale de l'échantillon. Remarque : Les expérimentateurs doivent établir une courbe standard basée sur leurs propres expériences. Pour chaque test, une courbe standard doit être établie pour chaque plaque enzymatique.