Kit ELISA VIH humain

Spécifications : 48T/96T

Plage de détection : 0,312 pg/mL– 10 pg/mL.

Sensibilité : La dose minimale détectée est inférieure à 0,1 pg/ml.

Précision : Le coefficient de variation intra-lot CV% est inférieur à 10 % ; le coefficient de variation inter-lots CV% est inférieur à 15 %.

Taux de récupération : Le taux de récupération se situe entre 85 % et 115 %.

Spécificité : Ce kit reconnaît le VIH humain naturel et recombinant sans croisement avec des analogues structurels. Stabilité : Stockage à 2℃-8℃, valide pendant 6 mois.

Utilisation : Utilisé pour détecter la concentration de  VIH humain dans des échantillons tels que le sérum, le plasma, le surnageant de culture cellulaire et les tissus.

 

Principe expérimental

Ce kit utilise un dosage immuno-enzymatique (ELISA) en sandwich à double anticorps. Dans la plaque enzymatique microporeuse pré-enduite d'anticorps anti-VIH humain (anticorps en phase solide), le calibrateur VIH humain et l'échantillon à tester ont été ajoutés, puis un anticorps anti-VIH humain marqué à la HRP (anticorps marqué à l'enzyme) a été ajouté. Après incubation et lavage complet, les composants non liés ont été éliminés, et un complexe sandwich anticorps en phase solide-antigène-anticorps marqué à l'enzyme a été formé sur la surface en phase solide de la microplaque. Les substrats A et B sont ajoutés, et le substrat est catalysé par la HRP, ce qui produit le substrat qui est finalement converti en jaune sous l'action de la solution d'arrêt (solution acide). L'absorbance (valeur OD) a été mesurée à une longueur d'onde de 450 nm sur le lecteur de microplaques, et l'absorbance (valeur OD) était positivement corrélée à la concentration de  VIH dans l'échantillon à tester. En ajustant la courbe du calibrateur, la concentration de VIH dans l'échantillon peut être calculée.

 

Composants du kit et stockage : Les kits non ouverts sont conservés à 2-8 degrés et les kits périmés ne doivent pas être utilisés.

Composants	Configuration 48 trous	Configuration 96 trous	Conserver après ouverture
Plaque enzymatique pré-enduite	48T	96T	2-8℃ 14 jours
Standard	0,3mL*6 tubes	0,3mL*6 tubes	2-8℃ 14 jours
Dilution d'échantillon	3 ml	6 ml	2-8℃ 180 jours
Anticorps marqués à la HRP	5 ml	10 ml	2-8℃ 14 jours
Substrat chromogène A	3 ml	6 ml	2-8℃ 180 jours
Substrat chromogène B	3 ml	6 ml	2-8℃ 180 jours
Solution d'arrêt	3 ml	6 ml	2-8℃ 180 jours
Solution de lavage 20×	15 ml	25 ml	2-8℃ 180 jours
Membrane d'étanchéité	2 unités	2 unités
Manuel	1 exemplaire	1 exemplaire
Sac refermable	1	1

Les concentrations des calibrateurs sont :  10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 pg/ml  successivement.

 

Remarque :

 

1 : Avant utilisation, veuillez vérifier si l'étiquette et la quantité des réactifs dans le kit correspondent au tableau.

2 : Si les composants du kit doivent être réutilisés, assurez-vous qu'ils n'ont pas été contaminés après la dernière utilisation. 3 : La plaque de microtitration (plaque ELISA) n'a pas été utilisée en une seule fois. N'oubliez pas de la sceller et de la conserver à 2-8 °C.

 

Équipement de test requis fourni par l'utilisateur

 (non fourni, mais une assistance à l'achat est possible)

 

1) Lecteur de microplaques capable de détecter une absorbance de 450 nm

2) Pipette et embouts, réservoir de remplissage d'échantillons

3) Étuve à température constante de 37°C ou bain-marie

4) Tubes à essai, tubes à centrifuger, éprouvettes graduées, etc. pour la préparation des réactifs

5) Eau distillée ou eau déionisée

6) Agitateur vortex, agitateur pour microplaques

 

 

Notes

 

1) Ce produit est destiné uniquement à la recherche scientifique et ne doit pas être utilisé pour un diagnostic clinique.
2) À utiliser dans la période de validité indiquée sur le kit ; les produits périmés ne doivent pas être utilisés.

3) Ne pas mélanger avec des kits ou des composants d'autres fabricants, utilisez le diluant d'échantillon fourni avec le kit.

4) Si la valeur de l'échantillon est supérieure à la concentration la plus élevée de l'étalon, veuillez diluer l'échantillon de manière appropriée avant de procéder à une nouvelle mesure.

5) Les anticorps hétérophiles tels que les anticorps anti-souris humains présents dans l'échantillon à tester interféreront avec les résultats de la détection. Veuillez éliminer ce facteur avant de tester.

6) Les résultats obtenus par d'autres méthodes ne sont pas directement comparables aux résultats de ce kit.

7) Veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants en latex pour vous protéger pendant le test. En particulier lors du test d'échantillons de sang ou d'autres fluides corporels, veuillez respecter les réglementations nationales en matière de protection et de sécurité des laboratoires biologiques.

8) Incubez strictement selon le temps et la température prescrits pour garantir des résultats précis. Tous les réactifs doivent atteindre la température ambiante (20-25 °C) avant utilisation. Remettre au réfrigérateur immédiatement après utilisation.

9) Un lavage incorrect de la plaque peut conduire à des résultats inexacts. Assurez-vous d'aspirer le liquide dans les puits autant que possible avant d'ajouter le substrat. Ne laissez pas les micro-puits sécher pendant l'incubation.

10) Éliminez le liquide résiduel et les empreintes digitales sur le fond de la plaque, sinon cela affectera la valeur de DO.

11) Le liquide révélateur de couleur du substrat doit être incolore ou très clair.

12) Évitez la contamination croisée des réactifs et des échantillons pour éviter des résultats erronés.

13) Évitez l'exposition directe à une lumière intense pendant le stockage et l'incubation.

14) Le lecteur de microplaques utilisé pour la détection doit être équipé d'un filtre capable de détecter des longueurs d'onde de 450±10 nm, avec une plage de densité optique comprise entre 0 et 3,5. Il est recommandé de préchauffer l'appareil 15 minutes avant l'utilisation.

15) Le tube EP et l'embout de pipette utilisés dans le test sont à usage unique et il est strictement interdit de les mélanger.

 

Préparation et conservation des échantillons

            Ce qui suit ne sont que des directives générales pour le prélèvement et la conservation des échantillons. Lors du prélèvement et du stockage de tous les échantillons, l'azide de sodium ne doit pas être utilisé comme conservateur. Si l'échantillon n'est pas analysé immédiatement, il doit être aliquoté, congelé et les cycles de congélation-décongélation répétés doivent être évités.

Surnageant de culture cellulaire - centrifuger pour éliminer le précipité, analyser immédiatement ou aliquoter et stocker congelé à -20°C.

Sérum - Recueillir le sang dans un tube à essai propre, laisser coaguler à température ambiante pendant 30 minutes, centrifuger à 2000×g pendant 20 minutes et recueillir le sérum. Analyser immédiatement ou aliquoter et stocker congelé à -20°C.

Plasma - Utiliser de l'héparine, du citrate ou de l'EDTA comme anticoagulant et centrifuger à 2-8°C à 2000×g pendant 20 minutes dans les 30 minutes suivant le prélèvement sanguin. Pour éliminer les effets des plaquettes, il est recommandé de centrifuger à nouveau à 2-8°C à 10 000×g pendant 10 minutes. Analyser immédiatement ou aliquoter et cryoconserver à -20°C.

Lysat cellulaire - Pour les cellules adhérentes, retirer le milieu de culture et laver avec du PBS, une solution saline ou un milieu de culture sans sérum. Ajouter une quantité appropriée de lysat et pipeter plusieurs fois pour assurer un contact complet entre le lysat et les cellules. Habituellement, après 10 secondes, les cellules sont lysées. Pour les cellules en suspension, recueillir les cellules par centrifugation et laver avec du PBS, une solution saline ou un milieu de culture sans sérum. Ajouter une quantité appropriée de lysat, pipeter les cellules et agiter avec les doigts pour lyser complètement les cellules. Après une lyse suffisante, centrifuger à 10000-14000×g pendant 3-5 minutes et retirer le surnageant. Analyser immédiatement ou aliquoter et cryoconserver à -20°C.

Homogénat tissulaire - Rincer le tissu avec du PBS pré-refroidi (0,01 M, pH=7,4) pour éliminer le sang résiduel (les globules rouges lysés dans l'homogénat affecteraient les résultats de la mesure), et couper le tissu après pesée. Placer le tissu coupé et le volume correspondant de PBS (généralement dans un rapport poids/volume de 1:9, par exemple 1 g d'échantillon de tissu correspond à 9 ml de PBS. Le volume spécifique peut être ajusté de manière appropriée en fonction des besoins expérimentaux et doit être enregistré. Il est recommandé d'ajouter des inhibiteurs de protéase au PBS) dans un homogénéisateur en verre et broyer soigneusement sur glace. Pour lyser davantage les cellules tissulaires, l'homogénat peut être soumis aux ultrasons ou à des cycles de congélation-décongélation répétés. Enfin, centrifuger l'homogénat à 5000×g pendant 5 à 10 minutes et prélever le surnageant pour le test.

Urine – recueillir dans un tube stérile et centrifuger à 2000×g pendant 20 minutes. Recueillir soigneusement le surnageant. Si un précipité se forme, centrifuger à nouveau.

 

Préparation des réactifs

 

1. Avant utilisation, tous les composants doivent être réchauffés pendant au moins 60 minutes pour assurer un retour complet à la température ambiante.
2. Liquide de lavage concentré : Le liquide de lavage concentré sorti du réfrigérateur peut présenter des cristallisations, ce qui est un phénomène normal. Les cristaux doivent être complètement dissous par chauffage au bain-marie. Le liquide de lavage concentré et l'eau distillée sont dilués à 1:20, c'est-à-dire 1 part de liquide de lavage concentré pour 19 parts d'eau distillée. 3. Substrat : les liquides de substrat A et B doivent être mélangés soigneusement dans un rapport volumique de 1:1 avant utilisation, et utilisés dans les 15 minutes suivant le mélange.

 

Procédures opératoires :

Tous les réactifs et composants doivent d'abord être ramenés à température ambiante. Il est recommandé de réaliser des puits en double.

1. Préparer les solutions de travail des différents composants du kit selon la méthode décrite dans les instructions précédentes.

2. Retirer les barrettes nécessaires du sachet en aluminium, sceller les barrettes restantes avec le sachet refermable et les remettre au réfrigérateur.

3. Préparer les puits pour les standards, les puits à valeur 0, les puits à blanc et les puits pour échantillons. Ajouter 50 μL de standards de différentes concentrations dans chaque puits de standard, ajouter 50 μL de diluant d'échantillon pour les puits à valeur 0, ne rien ajouter dans les puits à blanc, et ajouter 50 μL de l'échantillon à tester.

4. En plus des puits à blanc, des puits de standard, des puits à valeur 0 et des puits d'échantillon, ajouter 100 μL d'anticorps de détection marqué à la peroxydase de raifort (HRP).

5. Couvrez la plaque de réaction avec un film scellant, incubez au bain-marie à 37°C ou dans une étuve à température constante à l'abri de la lumière pendant 60 minutes.

6. Retirez le film scellant, jetez le liquide, séchez en tapotant sur du papier absorbant, remplissez chaque puits avec du liquide de lavage, laissez reposer pendant 20 secondes, secouez pour éliminer le liquide de lavage, séchez en tapotant sur du papier absorbant, et répétez cette opération 5 fois. Si vous utilisez un laveur de plaques automatique, veuillez suivre la procédure d'utilisation du laveur de plaques et ajouter un programme de trempage de 30 secondes pour améliorer la précision de la détection. Après le lavage de la plaque, tapotez soigneusement la plaque de réaction sur du papier propre qui ne peluche pas avant d'ajouter le substrat. (Conseil : Pour obtenir des résultats expérimentaux idéaux, le liquide résiduel doit être complètement éliminé. Après le lavage de la plaque, veuillez effectuer l'étape suivante immédiatement et ne laissez pas la microplaque sécher.) 7. Mélangez bien les substrats A et B dans un rapport volumique de 1:1, et ajoutez 100 µL du mélange de substrats dans tous les puits. Couvrez la plaque de réaction avec un film scellant, incubez au bain-marie à 37°C ou dans une étuve à température constante pendant 15 minutes à l'abri de la lumière.

8. Ajoutez 50 µL de solution d'arrêt dans tous les puits et lisez l'absorbance (valeur DO) de chaque puits sur un lecteur de microplaques à une longueur d'onde de 450 nm.

Calcul des résultats

1. Utilisez la concentration de la substance étalon comme abscisse et l'absorbance correspondante (valeur DO) comme ordonnée. Utilisez un logiciel informatique et un ajustement de courbe logistique à quatre paramètres (4-pl) pour créer l'équation de la courbe étalon. À partir de l'absorbance (valeur DO) de l'échantillon, utilisez l'équation pour calculer la concentration de l'échantillon. [Effectuez le calcul à l'aide du logiciel ELISA Calc. Il est recommandé d'utiliser un ajustement à quatre paramètres pour la courbe étalon, mais ce n'est pas la seule méthode d'ajustement].

2. Si l'échantillon est dilué, la valeur de concentration mesurée par la méthode ci-dessus doit être multipliée par le facteur de dilution pour déterminer la concentration finale de l'échantillon. Remarque : Les expérimentateurs doivent établir une courbe étalon basée sur leurs propres expériences. Pour chaque test, une courbe étalon doit être établie pour chaque plaque enzymatique.