Réactif Tripure (équivalent au Trizol d'Invitrogen)

Tous les réactifs, lorsqu'ils sont conservés à la température indiquée, sont stables pendant 12 mois.

Réactifs nécessaires, mais non fournis :

1. Chloroforme
2. Alcool isopropylique
3. Éthanol à 75 % (dans de l'eau exempte d'ARN)
4. Eau exempte de RNase ou solution de SDS à 0,5 % [Pour préparer de l'eau exempte de RNase, verser de l'eau dans des flacons en verre exempts de RNase. Ajouter du diéthylpyrocarbonate (DEPC) à 0,01 % (v/v). Laisser reposer toute la nuit et autoclaver. La solution de SDS doit être préparée en utilisant de l'eau traitée au DEPC et autoclavée.]

AVERTISSEMENT : Toxique par contact cutané et par ingestion. Provoque des brûlures. Après contact avec la peau, laver immédiatement et abondamment avec du détergent et de l'eau. En cas de malaise, consulter un médecin (lui montrer l'étiquette si possible). Phénol (108-95-2) et autres composants (NJTSRN 80100437-5000p).

Description

Le réactif TRIpure est un réactif prêt à l'emploi destiné à l'isolement de l'ARN total à partir de cellules et de tissus. Le réactif, une solution monophasique de phénol et d'isothiocyanate de guanidine, constitue une amélioration de la méthode d'isolement de l'ARN en une seule étape. Lors de l'homogénéisation ou de la lyse de l'échantillon, le réactif TRIpure préserve l'intégrité de l'ARN tout en rompant les cellules et en dissolvant leurs composants.

L'ajout de chloroforme suivi d'une centrifugation sépare la solution en une phase aqueuse et une phase organique. L'ARN reste exclusivement dans la phase aqueuse. Après transfert de la phase aqueuse, l'ARN est récupéré par précipitation avec de l'alcool isopropylique. Après élimination de la phase aqueuse, l'ADN et les protéines présents dans l'échantillon peuvent être récupérés par des précipitations séquentielles. La précipitation avec de l'éthanol permet d'obtenir l'ADN à partir de l'interphase, et une précipitation supplémentaire avec de l'alcool isopropylique permet d'obtenir les protéines à partir de la phase organique. La copurification de l'ADN peut être utile pour normaliser les rendements en ARN d'un échantillon à l'autre.

Cette technique donne de bons résultats avec de petites quantités de tissus (50-100 mg) et de cellules (5 × 10⁶), ainsi qu'avec de grandes quantités de tissus (≥1 g) et de cellules (>10⁷), d'origine humaine, animale, végétale ou bactérienne.

La simplicité de la méthode utilisant le réactif TRIpure permet le traitement simultané d'un grand nombre d'échantillons. La procédure entière peut être réalisée en une heure. L'ARN total isolé par le réactif TRIpure est exempt de toute contamination par des protéines ou de l'ADN. Il peut être utilisé pour l'analyse par Northern blot, l'hybridation dot blot, la sélection de poly(A)+, la traduction in vitro, les tests de protection contre la RNase et le clonage moléculaire. Pour une utilisation dans la réaction en chaîne par polymérase (PCR), le traitement de l'ARN isolé avec de la DNase I de qualité amplification est recommandé lorsque les deux amorces se trouvent au sein d'un même exon.