Kit ELISA pour l'immunoglobuline A (IgA) humaine

Numéro de produit : YP-W11065

Spécification : 96T 

Plage de détection : 100 μg/mL – 3200 μg/mL.

Sensibilité : La dose minimale détectée est inférieure à 10 μg/mL.

Précision : Le coefficient de variation intra-lot CV% est inférieur à 10 % ; le coefficient de variation inter-lots CV% est inférieur à 15 %.

Taux de récupération : Le taux de récupération est compris entre 85 % et 115 %.

Spécificité : Ce kit reconnaît l'immunoglobuline A humaine (IgA) naturelle et recombinante sans réaction croisée avec des analogues structurels. Stabilité : Stockage à 2℃-8℃, valable 6 mois.

Utilisation : Utilisé pour détecter la concentration d'immunoglobuline A humaine (IgA) dans des échantillons tels que le sérum, le plasma, le surnageant de culture cellulaire et les tissus.

 

Principe expérimental

Ce kit utilise la méthode ELISA en sandwich à double anticorps. Dans la plaque enzymatique microporeuse pré-enduite avec un anticorps anti-immunoglobuline A humaine (IgA) (anticorps en phase solide), le calibrateur d'immunoglobuline A humaine (IgA) et l'échantillon à tester ont été ajoutés, puis l'anticorps anti-immunoglobuline A humaine (IgA) marqué à la HRP (anticorps marqué à l'enzyme) a été ajouté. Après incubation et lavage approfondi, les composants non liés ont été éliminés, et un complexe sandwich anticorps en phase solide-antigène-anticorps marqué à l'enzyme a été formé sur la surface en phase solide de la microplaque. Les substrats A et B sont ajoutés, le substrat est catalysé par la HRP, et le produit de substrat est généré, qui est finalement converti en jaune sous l'action de la solution d'arrêt (solution acide). L'absorbance (valeur DO) a été mesurée à une longueur d'onde de 450 nm sur le lecteur de microplaques, et l'absorbance (valeur DO) était positivement corrélée à la concentration d'immunoglobuline A (IgA) dans l'échantillon à tester. En ajustant la courbe du calibrateur, la concentration d'immunoglobuline A (IgA) dans l'échantillon peut être calculée.

Composants du kit et stockage Les kits non ouverts sont conservés à 2-8 degrés et les kits périmés ne doivent pas être utilisés.

Composants	Configuration 48 puits	Configuration 96 puits	Stockage après ouverture
Plaque enzymatique pré-enduite	48T	96T	2-8℃ 14 jours
Standard	Tube de 0,3 mL * 6	Tube de 0,3 ml*6	2-8℃ 14 jours
Dilution d'échantillon	3 ml	6 ml	2-8℃ 180 jours
Anticorps marqués à la HRP	5 ml	10 ml	2-8℃ 14 jours
Substrat colorigène A	3 ml	6 ml	2-8℃ 180 jours
Substrat colorigène B	3 ml	6 ml	2-8℃ 180 jours
Solution d'arrêt	3 ml	6 ml	2-8℃ 180 jours
Solution de lavage 20×	15 ml	25 ml	2-8℃ 180 jours
Film d'étanchéité	2 unités	2 unités
Manuel	1 exemplaire	1 exemplaire
Sac refermable	1	1

Les concentrations des calibrateurs sont :  3200、1600、800、400、200、100 μg/mL  dans cet ordre.

 

Remarque :

 

1 : Avant utilisation, veuillez vérifier si l'étiquette et la quantité des réactifs dans le kit correspondent au tableau.

2 : Si les composants du kit doivent être réutilisés, assurez-vous qu'ils ne sont pas contaminés après la dernière utilisation. 3 : La plaque enzymatique n'a pas été utilisée pour une seule fois. N'oubliez pas de la sceller et de la conserver à 2-8°C.

 

Équipement de test fourni par l'utilisateur requis pour le test

 (non fourni, mais une aide à l'achat est possible)

 

1) Lecteur de microplaques capable de détecter une absorbance de 450 nm

2) Pipette et embout de pipette, réservoir de remplissage d'échantillon

3) Étuve à température constante à 37°C ou bain-marie

4) Tubes à essai, tubes à centrifuger, éprouvettes graduées, etc. pour la préparation des réactifs

5) Eau distillée ou eau déionisée

6) Agitateur vortex, agitateur de microplaques

 

 

Remarques

 

1) Ce produit est destiné à la recherche scientifique uniquement et ne doit pas être utilisé pour un diagnostic clinique.
2) À utiliser dans la période de validité indiquée sur le kit ; les produits périmés ne doivent pas être utilisés.

3) Ne pas mélanger avec des kits ou des composants d'autres fabricants, utiliser le diluant pour échantillon fourni avec le kit.

4) Si la valeur de l'échantillon est supérieure à la concentration standard la plus élevée, veuillez diluer l'échantillon de manière appropriée avant de procéder à une nouvelle mesure.

5) Les anticorps hétérophiles, tels que les anticorps anti-souris humains présents dans l'échantillon à tester, interféreront avec les résultats de la détection. Veuillez éliminer ce facteur avant le test.

6) Les résultats de test obtenus par d'autres méthodes ne sont pas directement comparables aux résultats de test de ce kit.

7) Veuillez porter des vêtements de laboratoire et des gants en latex pour vous protéger pendant le test. En particulier lors du test d'échantillons de sang ou d'autres fluides corporels, veuillez respecter les réglementations nationales en matière de protection et de sécurité des laboratoires de biologie.

8) Incuber strictement conformément au temps et à la température prescrits pour garantir des résultats précis. Tous les réactifs doivent atteindre la température ambiante (20-25°C) avant utilisation. Remettre au réfrigérateur immédiatement après usage.

9) Un lavage incorrect de la plaque peut conduire à des résultats inexacts. Assurez-vous d'aspirer le liquide dans les puits autant que possible avant d'ajouter le substrat. Ne laissez pas les micropuits sécher pendant l'incubation.

10) Éliminez le liquide résiduel et les empreintes digitales sur le fond de la plaque, sinon cela affectera la valeur de DO (densité optique).

11) Le liquide de production de couleur du substrat doit être incolore ou très clair.

12) Évitez la contamination croisée des réactifs et des spécimens afin de ne pas obtenir de résultats erronés.

13) Évitez l'exposition directe à une lumière forte pendant le stockage et l'incubation.

14) Le lecteur de microplaques utilisé pour la détection doit être équipé d'un filtre capable de détecter des longueurs d'onde de 450±10 nm, avec une plage de densité optique entre 0 et 3,5. Il est recommandé de le faire chauffer 15 minutes à l'avance.

15) Le tube EP et l'embout de pipette utilisés lors du test sont à usage unique et il est strictement interdit de les mélanger.

 

Préparation et conservation des échantillons

            Les directives suivantes ne sont que des recommandations générales pour le prélèvement et la conservation des échantillons. Lors du prélèvement et du stockage de tous les échantillons, l'azoture de sodium ne doit pas être utilisé comme conservateur. Si l'échantillon n'est pas analysé immédiatement, il doit être aliquoté et congelé, en évitant les cycles de congélation-décongélation répétés.

Surnageant de culture cellulaire - centrifugez pour éliminer le précipité, analysez immédiatement ou aliquotez et conservez congelé à -20°C.

Sérum - Recueillez le sang dans un tube à essai propre, laissez coaguler à température ambiante pendant 30 minutes, centrifugez à 2000×g pendant 20 minutes et recueillez le sérum. Analysez immédiatement ou aliquotez et conservez congelé à -20°C.

Plasma - Utilisez de l'héparine, du citrate ou de l'EDTA comme anticoagulant et centrifugez à 2-8°C à 2000×g pendant 20 minutes dans les 30 minutes suivant le prélèvement sanguin. Pour éliminer les effets des plaquettes, il est recommandé de centrifuger davantage à 2-8°C à 10 000×g pendant 10 minutes. Analysez immédiatement ou aliquotez et conservez par cryogénie à -20°C.

Lysat cellulaire - Pour les cellules adhérentes, retirez le milieu de culture et lavez-les avec du PBS, une solution saline ou un milieu de culture sans sérum. Ajoutez une quantité appropriée de lysat et pipettez plusieurs fois pour assurer un contact complet entre le lysat et les cellules. Généralement, après 10 secondes, les cellules sont lysées. Pour les cellules en suspension, recueillez les cellules par centrifugation et lavez-les avec du PBS, une solution saline ou un milieu de culture sans sérum. Ajoutez une quantité appropriée de lysat, pipettez les cellules, puis tapotez avec vos doigts pour lyser complètement les cellules. Après une lyse suffisante, centrifugez à 10 000-14 000×g pendant 3-5 minutes et retirez le surnageant. Analysez immédiatement ou aliquotez et conservez par cryogénie à -20°C.

Homogénat de tissu - Rincez le tissu avec du PBS pré-refroidi (0,01 M, pH=7,4) pour éliminer le sang résiduel (les globules rouges lysés dans l'homogénat affecteront les résultats de mesure), puis coupez le tissu après l'avoir pesé. Placez le tissu découpé avec le volume correspondant de PBS (généralement dans un rapport poids-volume de 1:9 ; par exemple, 1 g d'échantillon de tissu correspond à 9 mL de PBS. Le volume spécifique peut être ajusté en fonction des besoins expérimentaux et doit être enregistré. Il est recommandé d'ajouter des inhibiteurs de protéases au PBS) dans un homogénéiseur en verre et broyez soigneusement sur de la glace. Pour lyser davantage les cellules tissulaires, l'homogénat peut être soniqué ou soumis à des cycles de congélation-décongélation répétés. Enfin, centrifugez l'homogénat à 5000×g pendant 5 à 10 minutes, puis prélevez le surnageant pour le test.

Urine – recueillez-la dans un tube stérile et centrifugez à 2000×g pendant 20 minutes. Prélevez soigneusement le surnageant. Si un précipité se forme, centrifugez à nouveau.

 

Préparation des réactifs

 

1. Avant utilisation, tous les composants doivent être réchauffés pendant au moins 60 minutes pour garantir qu'ils reviennent complètement à température ambiante.
2. Solution de lavage concentrée : La solution de lavage concentrée sortie du réfrigérateur peut présenter des cristaux, ce qui est un phénomène normal. Les cristaux se dissolvent complètement par chauffage au bain-marie. Diluez la solution de lavage concentrée et l'eau distillée dans un rapport de 1:20, c'est-à-dire 1 volume de solution de lavage concentrée pour 19 volumes d'eau distillée. 3. Substrat : pour les solutions de substrat A et B, mélangez-les soigneusement dans un rapport volumique de 1:1 avant utilisation, et utilisez-les dans les 15 minutes suivant le mélange.

 

Procédures opératoires :

Tous les réactifs et composants doivent d'abord être ramenés à température ambiante, et il est recommandé de créer des puits pour les composés.

1. Préparer le liquide de travail des différents composants du kit selon la méthode décrite dans les instructions précédentes.

2. Retirer les barrettes nécessaires du sachet en aluminium, sceller les barrettes restantes dans un sachet auto-obturant et les remettre au réfrigérateur.

3. Préparer les puits pour les étalons, les puits à valeur 0, les puits à blanc et les puits pour échantillons. Ajouter 50 μL d'étalons de différentes concentrations dans chaque puits d'étalon, ajouter 50 μL de diluant pour échantillon dans les puits à valeur 0, ne rien ajouter dans les puits à blanc, et ajouter 50 μL de l'échantillon à tester.

4. En plus des puits à blanc, des puits d'étalons, des puits à valeur 0 et des puits pour échantillons, ajouter 100 μL d'anticorps de détection marqué à la peroxydase de raifort (HRP).

5. Couvrir la plaque de réaction avec un film scellant, incuber au bain-marie ou dans une étuve à température constante à 37 °C, à l'abri de la lumière, pendant 60 minutes.

6. Retirer le film scellant, jeter le liquide, éponger sur du papier absorbant, remplir chaque puits avec le liquide de lavage, laisser reposer pendant 20 s, secouer pour éliminer le liquide de lavage, éponger sur du papier absorbant et répéter cette opération 5 fois. Si vous utilisez un laveur de plaques automatique, veuillez suivre la procédure d'utilisation du laveur de plaques et ajouter un programme de trempage de 30 secondes pour améliorer la précision de la détection. Après le lavage de la plaque, tapoter soigneusement la plaque de réaction sur du papier propre qui ne peluche pas avant d'ajouter le substrat. (Conseil : Pour obtenir des résultats expérimentaux idéaux, le liquide résiduel doit être complètement éliminé. Après le lavage de la plaque, veuillez effectuer l'étape suivante immédiatement et ne pas laisser la microplaque sécher.) 7. Bien mélanger les substrats A et B dans un volume de 1:1, et ajouter 100 μL de mélange de substrats dans tous les puits. Couvrir la plaque de réaction avec un film scellant, incuber au bain-marie ou dans une étuve à température constante à 37 °C pendant 15 minutes, à l'abri de la lumière.

8. Ajouter 50 μL de solution d'arrêt dans tous les puits et lire l'absorbance (valeur DO) de chaque puits sur un lecteur de microplaques à une longueur d'onde de 450 nm.

 

Calcul des résultats

 

1.        Utiliser la concentration de la substance étalon comme abscisse et l'absorbance correspondante (valeur DO) comme ordonnée. Utiliser un logiciel informatique et un ajustement de courbe logistique à quatre paramètres (4-pl) pour créer une équation de courbe étalon. À partir de l'absorbance (valeur DO) de l'échantillon, utiliser l'équation pour calculer la concentration de l'échantillon. [Calculer à l'aide du logiciel ELISA Calc. Il est recommandé d'utiliser un ajustement à quatre paramètres pour la courbe étalon, mais ce n'est pas la seule méthode d'ajustement].

2.        Si l'échantillon est dilué, la valeur de concentration mesurée par la méthode ci-dessus doit être multipliée par le facteur de dilution pour déterminer la concentration finale de l'échantillon. Remarque : Les expérimentateurs doivent établir une courbe étalon basée sur leurs propres expériences. Pour chaque test, une courbe étalon doit être établie pour chaque plaque enzymatique.